细胞培养操作细则

细胞培养是为了简化细胞的生长环境，方便控制实验因素，尽管与体内生长的细胞存在或多或少的差异，但是可提供易于观测的实验结果。此外可培养的细胞种类广泛，能同时提供大量且均一性良好的细胞群。但是细胞培养对环境和操作要求严格。所以如果使用细胞培养技术则需要非常注意其操作要点。
本文针对的是不同种细胞培养的通用步骤，包括细胞房注意事项、细胞复苏、细胞冻存、细胞传代、细胞铺板、药物配制6个方面。其中具体是参数需要实验人员自行设定。

细胞培养前期准备

标准原料

•    细胞完全培养液的配制：纯培养液倒入50 mL离心管中至45 mL，用枪补加5 mL牛血清（培养液中牛血清含量10%），双抗500 μL，部分细胞还需额外添加营养物或抗氧化剂（如Thp-1细胞需要添加一定量的β-巯基乙醇和L-谷氨酰胺）。(视情况而定)
•    细胞冻存液的配制：纯培养液：牛血清：DMSO=7:2:1，对于部分难以冻存后死亡率较高的细胞，可以提高冻存液中牛血清的比例。<b>现配现用</b>

设备

•    培养箱
•    离心机

化学试剂

•    细胞纯培养液：DMEM、1640 等，灭菌
•    胎牛血清
•    DMSO
•    无菌PBS
•    双抗
•    胰酶

步骤

进入细胞房要求

• 带口罩、双层手套，更换隔离服（有些隔离服袖口较松，建议带上皮筋扎紧袖口，否则会袖子会干扰工作，甚至碰到酒精灯引发危险，敞开的袖口也增加了操作过程中污染的概率）。
• 喷洒酒精在袖子（尤其是袖口）、衣服前襟处。
• 如果从外面带了物品进细胞房，也要用酒精喷一遍。
• 将细胞从外界放入培养箱前，用酒精棉小心地擦拭一遍器皿的底部，尤其是器皿盖子处。
• 在超净台操作时，尽量避免长时间将盛有细胞的器皿敞口放置，同时注意拿取物品时，袖子尽量避免从敞口器皿上面经过，否则袖子袖口上面的纤维极其黏附细菌等极易掉入，导致污染。

细胞复苏

• 用酒精棉擦拭超净台、枪头；
• 提前15 min 打开超净台；
• 准备37℃水浴；
• 将细胞从液氮罐/超低温冰箱中拿出，迅速置于水浴中融化，注意冻存管的口部不要没过水面以下，以免增加细胞污染的概率；（可将冻存管置于一次性PE手套中以免污染，以1min融化为宜）
• 待细胞全部融化好，迅速将冻存管置于离心机，800 rpm, 5 min 离心；根据细胞脆弱程度调整离心转速和时间
• 小心用镊子将冻存管从离心机中夹出，置于超净台，倒去冻存液，尽量倒净。
• 向冻存管中加入 1mL 完全培养液，重悬细胞后加入培养瓶/皿，并补充新鲜完全培养液（培养瓶中一般培养液总体积4-6mL，培养皿中为8-10 mL）。
• 将培养瓶/皿放入培养箱。

*注意事项：

全程注意无菌操作；
37℃水浴锅提前打开；
水浴时候，要做到速溶，因为回温太慢会形成冰晶损伤细胞；
时间不宜过长，因为细胞冻存液对细胞有害；
液氮操作有危险，戴手套记得带两层；

细胞冻存

• 用酒精棉擦拭超净台、枪头；
• 提前15 min 打开超净台；
• 根据所要冻存的细胞数量配制冻存液。一般将长满90%细胞的培养瓶按照1管或2管冻存，每管装入1.5-2 mL冻存液。
• 如果细胞冻存数量较大（超过6管），建议提前取出冻存管，并依次做好标记，标记包括：姓名、时间、细胞种类、代数等。
• 将准备冻存的细胞拿出培养箱，放进超净台，弃去培养液，用无菌PBS清洗三次。
• 向培养瓶中加入1 mL胰酶（培养皿则为2 mL），轻晃使之盖满瓶底，移入培养箱，消化几分钟（不同细胞消化时间不定）后拿出，在显微镜下观察，发现细胞与细胞之间出现缝隙，细胞变圆。
• 加入1-2 mL的完全培养液终止胰酶的反应，用枪将细胞全部吹打下来，移入5 mL离心管。
• 离心，800 rpm，5 min。
• 弃上清。
• 加入2 mL PBS重悬细胞，离心，800 rpm，5 min，重复这一步骤共三遍。
• 弃上清，加入一定量的细胞冻存液，移入冻存管，管上做好标记，贴上封口膜。
• 取一层棉花，包裹住细胞，迅速放入-80℃冰箱24 h。
• 24 h后，将冻存的细胞移入液氮罐。
• 每次放入细胞时，需观察液氮是否还充足，如不足，及时告知负责人。

贴壁细胞传代

• 用酒精棉擦拭超净台、枪头；
• 提前15 min 打开超净台。
• 将准备传代的细胞拿出培养箱，放进超净台，弃去培养液，用无菌PBS清洗三次。
• 向培养瓶中加入1 mL胰酶（培养皿则为2 mL），轻晃使之盖满瓶底，移入培养箱，消化几分钟（不同细胞消化时间不定）后拿出，在显微镜下观察，发现细胞与细胞之间出现缝隙，细胞变圆。
• 加入1-2 mL的完全培养液终止胰酶的反应，用枪将细胞全部吹打下来，移入5 mL离心管。
• 离心，800 rpm，5 min。同上，根据
• 弃上清。
• 加入2 mL PBS重悬细胞，离心，800 rpm，5 min，重复这一步骤共三遍。
• 弃上清，加入一定量培养液，吹打混匀（极其重要！），分装到几个培养瓶中并补充培养液（一般细胞可按照一瓶传两到三瓶操作，如一传二，则可加入2 mL 培养液吹打混匀后分装1 mL到两个培养瓶中，再向两个瓶中补充新鲜培养液）。
• 将细胞移入培养箱。

*注意事项

细胞在培养过程中会产生代谢废物，且pH会有改变，此外牛血清等物质会干扰胰酶发挥作用，所以需要用PBS进行清洗；
细胞生长到70%+左右可以考虑传代；
细胞重悬时，尽量吹散；
吹打时动作轻柔，避免产生气泡；
严格控制胰酶消化时间；

细胞铺板

• 用酒精棉擦拭超净台、枪头；
• 提前15 min 打开超净台。
• 将准备铺板的细胞拿出培养箱，放进超净台，弃去培养液，用无菌PBS清洗三次。
• 向培养瓶中加入1 mL胰酶（培养皿则为2 mL），轻晃使之盖满瓶底，移入培养箱，消化几分钟（不同细胞消化时间不定）后拿出，在显微镜下观察，发现细胞与细胞之间出现缝隙，细胞变圆。
• 加入1-2 mL的完全培养液终止胰酶的反应，用枪将细胞全部吹打下来，移入5 mL离心管。
• 离心，800 rpm，5 min。
• 弃上清。
• 加入2 mL PBS重悬细胞，离心，800 rpm，5 min，重复这一步骤共三遍。
• 弃去PBS，用1mL完全培养液重悬细胞，根据收据的细胞的数量，取细胞重悬液20uL进行稀释计数，一般稀释10到100倍，普通培养瓶细胞近满稀释10倍即可，培养皿可稀释100倍。取10uL稀释液加入细胞计数板，在显微镜下计数，而后按照稀释倍数折算细胞数量，
• 根据所进行的实验稀释细胞。
NOTE：
96孔板：96孔板通常用来进行酶标仪读数或高内涵拍摄，实验多为CCK-8、ROS、iNOS等，一般进行CCK-8实验时保证96孔板每孔5000-20000个细胞/100或200uL培养液，细胞数量根据细胞数量、实验时间长短有所不同，如RAW 264.7细胞生长快，12h数量可翻倍，则细胞数量宜少不宜多。进行其它如活性氧检测等实验时，细胞数量可略多于CCK-8实验所需数量。
6孔板、12孔板等：通常用来进行蛋白抽提、RNA抽提、流式检测等。铺板密度大约在1×10^6 cells/mL，可根据具体实验目的对细胞数量进行调整。

具体细胞培养信息

EA.hy926细胞

EA.hy926细胞基本属性

属性名	属性
细胞名称	EA.hy926(人脐静脉细胞融合细胞)(STR鉴定正确)
细胞别称	EA. hy 926; EA hy 926; EAhy 926; EAHY-926; EA.Hy926; EA.hy926; EAhy926; EaHy926; Eahy926
来源	脐静脉；内皮细胞；A549融合；女性
细胞形态	上皮细胞样
细胞类型	杂交细胞
生长特性	贴壁细胞
生物安全等级	1
培养条件	DMEM+10% FBS+1% P/S
培养环境	空气，95% ； 二氧化碳 (CO2)，5%
细胞简介	EA.hy926细胞是将原代培养的人脐静脉细胞与抗硫鸟嘌呤的A549/8细胞通过PEG融合，构建的一株人脐静脉细胞株，杂交细胞在HAT培养基上生长，并以Ⅷ因子相关抗原筛选。EA.hy926细胞已经过100次以上的群体倍增(PDLs)，电镜照片显示细胞Weibel-Palade小体的细胞质分布以及组织特异性的细胞器。EA.hy926细胞表现分化的内皮细胞特性如血管生成，体内平衡-血栓形成，血压及炎症反应。

EA.hy926细胞培养操作

属性名	属性
换液周期	2-3天
培养基体积	T25瓶10-12ml；10cm皿12-15ml
传代比例	1:2-1:4（具体情况视细胞生长速度及密度决定）
传代方法	1.尽量吸干净T25瓶原培养基；

2.加3-4ml 常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；
3.T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层；
4.将培养瓶放入37度培养箱消化；
5.消化到细胞间隙变大，但未完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消化；
6.混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；
7.加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里；
8.补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养； |
| 注意事项 | 不同品牌胰酶消化时间差别较大，注意严格控制消化时间
消化传代细胞时吹打细胞注意尽量轻柔，不要产生过多气泡以免影响细胞状态。 |

EA.hy926细胞培养操作

属性名	属性
冻存液配方	92%FBS+8%DMSO(新手推荐)或92%完全培养基+8%DMSO(高手推荐);
冻存规格	200-300万/ml，1ml每管
冻存方法	1.消化并离心获得细胞沉淀后，加配置好的冻存液轻轻重悬细胞；

2.将细胞悬液尽快移入已经做好标记的冻存管；
3.将冻存管转入程序冻存盒，放入-80度冰箱过夜，第二天转入液氮保存；没有程序冻存盒的实验室，加入细胞后可以将冻存管放在泡沫盒中4度静置5-10min，再-20度静置2h后转入-80度过夜，第二天转入液氮保存 |
| 注意事项 | 冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案 |

EA.hy926细胞形态

LX-2细胞

LX-2细胞基本属性

属性名	属性
细胞名称	LX-2 (人肝星形细胞) (STR鉴定正确)
细胞别称	Lieming Xu-2
来源	人
细胞形态	上皮细胞样
生长特性	贴壁细胞
培养条件	DMEM＋10% FBS＋1% P/S
培养环境	空气，95% ； 二氧化碳 (CO2)，5%； 温度 37℃
推荐传代比例	1：2-1：4
推荐换液频率	2~3次/周

LX-2细胞形态